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        深圳市安必勝  

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        開(kāi)發(fā)一種多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測法檢測 原料中反芻動(dòng)物DNA監測肝素鈉粗品質(zhì)量

        來(lái)源:深圳市安必勝科技有限公司 轉載請注明出處 2013年8月

        原文鏈接

        作者

        Sharla M. Peters1, Yolanda L. Jones1, Frank Perrella2, Tai Ha3, and Haile F. Yancy1

         

        1U. S. Food and Drug Administration, Center for Veterinary Medicine, Office of Research, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA. 2U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Compliance, Silver Spring, MD 20993, USA. 3Nebraska Department of Agriculture, 301 Centennial Mall South, Lincoln, Nebraska 68508, USA.

         

        摘要

        開(kāi)發(fā)一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測豬源肝素鈉粗品中的反芻動(dòng)物源污染。該檢測法由一套針對反芻動(dòng)物(牛、綿羊、山羊)和豬的凍干引物、探針及內參組成。該方法經(jīng)過(guò)兩處分析機構驗證:第一個(gè)位于FDA,第二個(gè)位于某州獨立實(shí)驗室。肝素鈉多重實(shí)時(shí)熒光定量PCRhMRTA)檢測方法性能通過(guò)了美國FDA獸藥中心研發(fā)處制定的特異性、靈敏度和專(zhuān)一性嚴格驗收標準。符合早前建立的飼料中反芻動(dòng)物原料多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測法的靈敏度和重復性要求。hMRTA法檢測豬源肝素鈉粗品, 98%達靈敏度,真陽(yáng)性98%、假陰性2%。PCR檢測法檢測三個(gè)反芻動(dòng)物物種,可作為判定豬屬來(lái)源的初步篩選、復查確認工具。進(jìn)一步保證肝素鈉粗品質(zhì)量,幫助識別控制肝素鈉生產(chǎn)來(lái)源物種。對粗品肝素鈉的來(lái)源控制將保障含肝素鈉藥物和耗材的安全性,保護公眾健康。

         

        介紹

        肝素鈉粗品質(zhì)量監控的工業(yè)指南 (草案),旨在幫助藥物活性成分、藥品及醫療器械生產(chǎn)廠(chǎng)家更好地控制使用的肝素鈉粗品的質(zhì)量,防止OSCS或來(lái)自反芻動(dòng)物的污染。要求使用者建立適當的測試方法或使用USP方法來(lái)鑒別和控制動(dòng)物來(lái)源的肝素鈉粗品質(zhì)量。USP專(zhuān)論里已作出規定,肝素鈉應明確標明動(dòng)物種類(lèi)及器官組織的來(lái)源。要求采購肝素鈉粗品的藥物和醫療器械廠(chǎng)家要對每批肝素鈉粗品在生產(chǎn)或準備生產(chǎn)含肝素鈉藥物或醫療器械前要鑒別其物種來(lái)源。

        以下測定方法使用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測肝素鈉粗品反芻動(dòng)物污染。用豬源、牛源標準物評估可靠性。識別豬源肝素鈉粗品中的反芻動(dòng)物DNA。

        操作指南提供了方法的具體細節,包括所需試劑、設備。

         

        材料及方法

        建議每批待測樣品(提取、純化去雜質(zhì)和PCR)都設立陰性對照。并同時(shí)給每批BioGX Ruminant and Porcine Beads設置商業(yè)化基因組DNA(牛、豬、山羊、綿羊)陽(yáng)性對照。

         

        1、DNA提取

        介紹:

        0.5ml干燥肝素鈉粗品中提取DNA的方法描述如下:請在提取操作開(kāi)始前通讀整篇標準操作流程。本方法使用了Invitrogen (Carlsbad, CA)生產(chǎn)的ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit。所有的試劑、槍頭和離心管均為DNase free。 槍頭需有氣溶膠抗性(Aerosol resistant),減少從DNA提取到PCR擴增過(guò)程中樣品之間的交叉污染。因處理的是粉狀物質(zhì),建議步驟1、2帶上口罩,并與DNA提取、純化和PCR地點(diǎn)隔離。

        注意:粗品肝素鈉的PCR檢測需在其它會(huì )影響DNA完整性的任何前處理(如化學(xué)氧化)前進(jìn)行,以免影響PCR物種檢測結果。

         

        1.1. 所需材料:

        試劑盒:

        ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit (Product #CS400-100)

        PowerClean® DNA Clean-Up Kit (Product# 12877-50)

        BioGX Ruminant and Porcine Beads (Product # 204-0002)

         

        設備要求:

        Micro centrifuge

        Heat Block

        Nuclease Free Water

        Vortex

        Invitrogen Magna Rack

        2.0 mL Tubes

        Smart-Cycler

        Smart Cycler centrifuge

        Smart Cycler cooling block

        SmartCycler 25 µL reaction tubes

         

        1.2. 操作步驟

        a. 加入混勻的肝素鈉樣品到2ml離心管的0.5ml標記線(xiàn)。

             *關(guān)鍵步驟:每次只加一個(gè)樣,前一個(gè)樣品加樣完成前不能打開(kāi)下一個(gè)離心管。

        b. 加入1ml ChargeSwitch Lysis Buffer到樣品中。往離心管加入裂解緩沖液時(shí),離心管稍微傾斜。

        c. 每樣加入100μl ChargeSwitch SDS。渦旋5s混勻。

        d. 95℃孵育(水浴或加熱箱)5min。

        e. 每樣加入400μl ChargeSwitch Precipitation BufferN5)。渦旋5s混勻。

        f. 冰浴離心管5min沉淀蛋白。

        g. 室溫16100g離心5min。

        h. 轉移1200μl上清液到一個(gè)新的離心管中。

        i. 渦旋裝有ChargeSwitch Magnetic Beads的離心管,充分重懸浸泡在儲存緩沖液中的磁珠。

        j. 加入200μl ChargeSwitch Detergent到含上清液的離心管中。

        k. 加入40μl充分重懸的ChargeSwitch Magnetic Beads。

        l. 上下吹打5次混勻。

        m. 室溫孵育1min。

        n. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀,上清變清澈(約

        1min)。

        o. 離心管留在磁鐵上,小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對著(zhù)沉淀物。

        p. 從磁鐵取下離心管。

        q. 加入1ml ChargeSwitch Wash Buffer到離心管,上下吹打5次混勻。

        r. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀,上清變清澈(約

        1min)。

        s. 離心管留在磁鐵上,小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對著(zhù)沉淀物。

        t. 從磁鐵取下離心管。

        u. 加入750μl  ChargeSwitch Wash Buffer到離心管,上下吹打5次混勻。

        v. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀,上清變清澈(約

        1min)。

        w. 離心管留在磁鐵上,小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對著(zhù)沉淀物。

        x. 加入750μChargeSwitch Wash Buffer到離心管,上下吹打5次混勻。

        y. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀,上清變清澈(約

        1min)。

        z. 離心管留在磁鐵上,小心吸掉上清不攪渾沉淀。吸取上清時(shí)槍頭不要對著(zhù)沉淀物。最后一次

        清洗,吸掉所有上清。

        aa. 從磁鐵取下離心管,此時(shí)管內不應有上清液。

        bb. 加入75μl ChargeSwitch Elution BufferE5到離心管。

        cc. 輕輕上下吹打10次重懸ChargeSwitch Magnetic Beads。

        dd. 室溫孵育1min。

        ee. 把離心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成緊密沉淀,上清變清澈(約

        1min)。

        ff. 離心管留在磁鐵上,小心轉移含有DNA的上清到一個(gè)新的滅菌了的2ml離心管中,勿攪動(dòng)

        沉淀。吸取上清時(shí),槍頭不要對著(zhù)沉淀。

        gg. 棄去用過(guò)了的ChargeSwitch Magnetic Beads。

        *DNA -20℃冷凍保存或繼續進(jìn)行DNA純化去雜質(zhì)

         

        2. DNA純化去雜質(zhì) 

        介紹:

        下文描述如何去除以上提取的肝素鈉粗品DNA PCR抑制因子(如肝素)。在純化去雜質(zhì)開(kāi)始前需通讀整篇標準操作流程。本段使用MOBIOCarlsbad, CA)的PowerClean® DNA Clean-Up Kit。試劑盒提供的所有試劑盒離心管均DNase free。

         

        2.1. 操作步驟

        a. 加入75μl nuclease free水到DNA樣品中。

        b. 加入750μl PowerClean DNA Solution 1DNA中。上下顛倒3-5次混勻。

        c. 加入20μl PowerClean DNA Solution 2,上下顛倒3-5次混勻。 

        注意:檢查PowerClean DNA Solution 2,若有沉淀,60℃水浴并輕搖直至沉淀全部溶解。不要劇烈搖晃以免產(chǎn)生大量泡沫?沙脽崾褂。

        d. 加入85μl PowerClean DNA Solution 3,上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。

        e. 室溫10000g離心1min。

        f. 避開(kāi)沉淀,轉移所有上清到一個(gè)干凈的2ml Collection Tube(試劑盒提供)中。

        g. 加入70μl PowerClean DNA Solution 4,上下顛倒3-5次混勻。4℃孵育5min。

        h. 室溫10000g離心1min。

        i. 避開(kāi)沉淀,把上清轉移到一個(gè)干凈的2ml Collection Tube(試劑盒提供)中。

        j. 搖勻PowerClean DNA Solution 5。加入800μl PowerClean DNA Isolation 5到上清中,渦旋5s

        混勻。

        k. 加載600μl上清液到Spin Filter中,室溫10000g離心1min。

        l. 棄去濾液,把剩余的600μl上清都加到Spin Filter上,室溫10000g離心1min。

        m. 棄去濾液。加入500μl PowerClean DNA Solution 6Spin Filer,室溫10000g離心30s。

        n. 棄去濾膜。

        o. 室溫13000g離心2min。

        p. 小心把Spin Filter轉移到一個(gè)新的2ml Collection tube(試劑盒提供)中。避免沾到任何PowerClean DNA Isolation 6。

        q. 加入75μl PowerClean DNA Solution 7到白色濾膜中心。

        r. 室溫10000g離心30s。

        s. 棄去Spin Filter。-20℃冷凍保存直至PCR擴增。

         

         3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴增

        設計該操作流程/步驟是為使用CepheidSmartCycler分析豬源肝素樣品中反芻動(dòng)物DNA的存在。在其他操作平臺上使用該步驟需要適當的加以調整以驗證這部分是否符合(相對應平臺的)標準程序。

         

        3.1. 準備實(shí)時(shí)檢測

        a. 從冰箱中取出裝有樣品制備珠管的可重復用密封袋。從密封區域頂部的缺口
        撕開(kāi)袋子。

        b. 從袋中取出所需數量的管子,并輕輕打開(kāi)每一根管子。

        c. 向每管中加入25 µL無(wú)核酸水(無(wú)核酸污染的水),用槍頭混合后蓋上管蓋。

        d. 使用微量離心機將所有管子快速離心5s。

        e. 珠子空白對照(珠子+無(wú)DNA的水)必須與每一批待測樣品同時(shí)檢測。

         

        3.2. 步驟

        a. 分裝25 µL先前準備好的預混液(珠子和水)至SmartCycler PCR反應管。

        b. 向每一根對應的PCR反應管中加入1 µL樣品。

        c. 蓋上管蓋,在SmartCycler離心機中離心5s。

        d. PCR反應管放入SmartCycler區塊的每一孔中并蓋上各個(gè)蓋子。

        e. 準備運行程序:

        f. 點(diǎn)擊"Create Run"圖標。染料設置選擇FCTC。

        g. 選擇操作規程(見(jiàn)3.3部分)。

        h. 選擇適當數量的位點(diǎn)(即在運行的PCR管的數量)

        i. 給每一個(gè)位點(diǎn)標注一個(gè)與每管組分相對應的樣品ID。

        j. 點(diǎn)擊"Start Run"。

        注:陽(yáng)性結果需要有一個(gè)循環(huán)閾值(Ct值)。

         

        3.3 PCR反應條件

        這一操作規程必須在PCR運行開(kāi)始前加以設定。使用唯一的名稱(chēng)保存參數。

         

        PCR程序:

        第一階段:95.0°C 120s(光學(xué)元件關(guān)閉)

        第二階段:45個(gè)循環(huán)

        95.0°C 10s(光學(xué)元件關(guān)閉)

        56.0°C 60s(光學(xué)元件開(kāi)啟)

        注:分析時(shí),Ct值應設定成缺省值30

         

        4. 結果分析

        染料設定為FCTC,用于熒光檢測。反芻動(dòng)物DNA的陽(yáng)性結果的判定是一個(gè)樣品在FAM通道45個(gè)反應循環(huán)之前出現Ct值。豬的材料的陽(yáng)性結果是在TxR通道出現陽(yáng)性的Ct值。內部擴增控制(IAC)在Cy5通道中報告,有助于降低假陰性報告。許多不同類(lèi)型肝素樣品含有抑制劑。本試驗包括一個(gè)IAC,以確保PCR的條件是合適的,這樣,最大限度地減少由熱啟動(dòng)酶的抑制造成的假陰性結果報告。具體地講,IAC可以反映樣品中存在PCR抑制因子時(shí)報道的陰性結果。引物與探針能結合反應混合物中合成的序列。

        當樣品中沒(méi)有PCR抑制因子,而靶目標沒(méi)有擴增時(shí),IAC應當產(chǎn)生Ct值為32-37之間的信號。如果目標樣品是高濃度,IAC可能會(huì )也可能不會(huì )報告由于競爭而出現的擴增。這是正常的。

        如果IACCt37處仍未出現,或者在目的擴增中沒(méi)有報告(其Ct值),樣品可能含有阻止目的檢測的PCR抑制劑。如果觀(guān)察到這一結果,建議將分裝的新的肝素粗品重提并額外純化后使用。

        對于反芻動(dòng)物樣品的陽(yáng)性結果,應當用PCR對同一DNA樣品額外檢測兩次,即全部三次檢測結果均為陽(yáng)性的,則確認該樣品為陽(yáng)性。

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