為什么說從糞便樣品中提取DNA非常類似于提土壤

我們收到了許多研究者關于提取糞便樣品（fecal sample）DNA的咨詢電話。在此，提供一些關于糞便（stool）DNA提取的小建議。

糞便含有種類極其豐富的微生物群體，而每個人腸道內菌群又不一樣。糞便菌群的不同影響因素有很多。其中飲食結構對糞便的成分和性狀影響最大。素食者糞便中含有大量多糖、植物纖維，因此抑制因子也較多。使用抗生素干擾了腸道菌群的生存，改變了樣品中細菌的含量和分布。同樣，壽司等生冷食物也會對腸道微生物造成沖擊。

糞便樣品跟土壤比較類似，包含的微生物種類跟采樣地點有關。同樣的含有大量各種抑制因子。不同的樣品性狀還影響后續處理方法。它們更多共通點在于，如果你處理的是表土，樣品中會混雜一些土棲蠕蟲、鳥的排泄物，或者其它小型動物。這就是為什么MoBio的土壤DNA提取試劑盒也同樣適合于糞便樣品。

根據樣品類型不同，MoBio有好幾個試劑盒適合處理糞便類物質。糞便DNA提取（UltraClean Fecal DNA Kit）適合于抑制因子不多的樣品。強力土壤DNA提取（PowerSoil Kit）是處理含大量的PCR抑制因子樣品的首選。同時，它也是人類腸道微生物基因組研究計劃推薦處理辦法。不過有幾個步驟需要做改動。

操作說明書：

人體腸道微生物基因組研究計劃已經在其網站底部"Metagenomic WGS"部分公布了一套核酸提取標準操作步驟。

打開操作說明書第65頁，描述了強力土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）的實驗操作。

該操作說明書里頭，HMP研究者把搜集的2ml樣品加入到50ml Tube管中，并加入5ml研磨緩沖液[Bead Solution（cat# 12988-10-BS）]，然后分裝。

如果手上只有一個樣品需要處理。建議直接把糞便樣品加入到PowerSoil Kit的厚壁研磨管中（PowerBead tube），渦旋振蕩30~40s混勻樣品。

下一步加熱，以加強對微生物細胞裂解。

65℃加熱10分鐘，然后95℃加熱10分鐘。

加熱處理后，接著按照強力土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）標準實驗步驟進行。其中只需要在第12步稍作改動。即加入C3后離心時間由1分鐘增加到2分鐘。

DNA最終體積為100ul，可以不經處理進行基因測序。

糞便樣品狀態更接近于粘土，因此使用PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit可能會取得更好的提取效果。最近MoBio在研究使用玻璃研磨珠對提取粘土DNA得率進行改進。有了結果以后將第一時間公布結果。

工作原理：

有個理論可以解釋，為什么強力土壤DNA提取（PowerSoil）和糞便DNA提取（UltraClean Fecal）提取糞便樣品效果如此的好（拋開IRT除抑制因子步驟不說），使得最終得到的DNA絕大部分為微生物DNA。研磨珠擊打階段前，人類細胞已經在上述加熱步驟被裂解了。而微生物細胞需要研磨珠擊打破碎。游離的人類DNA在研磨珠擊打步驟被迅速切開降解，微生物DNA依然保持大分子結構。

試劑盒中DNA吸附綁定階段，使用的C4結合溶液（binding solution）只會捕捉大分子的DNA。RNA和小片段破碎DNA將在清洗階段被除去。這意味著進入下一步實驗的最終DNA中絕大部分為微生物DNA。在進行基因測序的時候，檢測到的信息主要就是關于腸道微生物的了。

[最新版的PowerFecal®已經在PowerSoil®的優良基礎上修改了說明書，推薦使用。]

糞便RNA

想提取糞便樣品中的RNA，請使用PowerMicrobiome™糞便RNA提取試劑盒（PowerMicrobiome™ Fecal RNA Isolation Kit）（請參看下文參考文獻）。該試劑盒一次可從大體積樣品中提取得到更多總RNA。如果你希望提取小量糞便樣品，請與我們聯系（anbiosci@126.com）。

人類腸道微生物相關文獻：

• Dominguez-Bello, M.G., E.K. Costello, M. Contreras, M. Magris, G. Hidalgo, N. Fierer, R. Knight. In Press. Delivery mode shapes the acquisition and structure of the founder microbiota across multiple body habitats in newborns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Jun 2010; 10.1073/pnas.1002601107.
• Fierer, N., C.L. Lauber, N. Zhou, D. McDonald, E.K. Costello, R. Knight. 2010. Forensic identification using skin bacterial communities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107: 6477-6481.
• Costello, E.K., C.L. Lauber, M. Hamady, N. Fierer, J.I. Gordon, R. Knight. 2009. Bacterial variation in human body habitats across space and time. Science. 326: 1694-1697

RNA PowerSoil Kit 提取糞便樣品

• Exfoliated Cells in Stool: A Source for Reverse Transcription-PCR–Based Analysis of Biomarkers of Gastrointestinal CancerYing Jie Yu, Adhip P.N. Majumdar, Jordan M. Nechvatal, Jeffrey L. Ram, Marc D. Basson, Lance K. Heilbrun, and Ikuko Kato. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.,Feb 2008; 17: 455 – 458.