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        磁珠法血液DNA/RNA的高通量提取

        作者:Michelle Tetreault Carlson 來源:美國MoBio實驗室【字號:

        兩個吸血鬼走進酒吧并叫來酒保

        "給我來杯血",一個吸血鬼說。

        "給我來杯血漿",另一個吸血鬼說。

        "好的"酒;卮,"一杯血和一杯軟血(Blood lite)!"

        (此處應該有笑聲)

        是的,我們在慶祝一個恐怖的季節,同時,也在此發布我們的新產品PowerMag Blood DNA/RNA Isolation kit。

        血液:里面有什么?

        血液中含有血漿、紅細胞、白細胞和血小板,它是非常獨特的一種樣品,因為血液中的核酸非常豐富,這座基因金礦被掩埋在各種的細胞碎片和蛋白混合物中,這些污染物會影響下游的PCR反應或測序,尤其是紅細胞里的血紅蛋白,它是影響DNA/RNA純度和抑制PCR反應的主要元兇。

        血液的采集和保存

        應該用抗凝管采集血液,否則血液凝集并把攜帶DNA/RNA的細胞都包埋起來。。常見準的血液采集管會使用EDTA或檸檬酸鹽抗凝。這兩種物質都不會干擾下游的基因分析。肝素也能抗凝,但它容易吸附DNA,所以不推薦。

        如果不能馬上處理,用于DNA提取的全血可以在4度最長保存2個星期,用于RNA提取的最長不超過2個小時。如果需要保存更長時間,則要做一些特殊處理了。如果只需要DNA,你可以將血液分裝成小份(250-500 μL)置于-20oC 或-80oC 長時間保存。 若要提取血液中的RNA,就需要當心了。RNA酶是一種很頑強的酶,即便在冷凍狀態下仍能發揮作用,如果不能馬上處理樣本,我們建議將血樣置于到RNA穩定液中,比如PAXgene™血液RNA管。在這些管子里頭,胞RNA在18°C到25°C可穩定保存3天,2°C到8°C可保存5天。

        另一方面,如果RNA中途要暫停,可把分離、裂解、凍存步驟沉淀的白細胞置于RNA酶抑制緩沖液中。例如,沉淀的白細胞可以置于PowerMag® Blood DNA/RNA Isolation kit所帶的PowerMag® 白細胞裂解液中,-20oC 或 -80oC保存,當你做好提取準備時,將樣品取出放在室溫,照接下來的步驟操作即可。

        從血液中獲得DNA或RNA

        PowerMag Blood DNA/RNA Isolation kit 中,利用了哺乳動物血液中,基因組DNA(gDNA)只存在于白細胞中,紅細胞和血小板中沒有核酸所以不含gDNA(禽類紅細胞例外)的特性,紅細胞或白細胞靠緩沖液來裂解。一般來講,1ml人血中白細胞的平均數大概7,000,000個。

        操作的第一步是用低滲緩沖液選擇性的裂解紅細胞。然后沉淀白細胞,去除上清中含有亞鐵血紅素的紅細胞。。往白細胞沉淀中加入裂解緩沖液以釋放核酸,像上面說到的,如果要提取RNA而又不能立馬處理,此處是可以將其放在(-20℃ 或-80 ℃)長期保存的時機,接下來使用ClearMag® 磁珠特異性捕獲核酸,去除雜質,再洗滌核酸,最后洗脫的核酸可直接用于下游反應。

        RNA和DNA的平均得率?

        沒有兩個血液樣本是一樣的。白細胞數量的不同會影響到提取的核酸的量,而白細胞數量會受采樣時宿主的健康狀況影響。不同種屬動物血液的核酸提取得率也不一樣。然而,每200ml MO BIO員工全血的DNA和RNA平均提取得率分別是3mg和1mg。

        高分子量的核酸

        如果你要用高通量的方法從血液中提取高分子量的核酸,這款試劑盒再合適不過了!我們已經用這款試劑盒提取到了高達100kb的DNA片段,如果你在尋找那些含量不高但片段很長的靶DNA以用于測序,使用這款血液試劑盒吧!

        說了這么多,實在餓了,我最好回到餐桌那去,我的水和大蒜們都在等我呢,萬圣節后見!

        參考文獻:

        1. Yokota M, Tatsumi N, Nathalang O, Yamada T, Tsuda I. (1999). "Effects of Heparin on Polymerase Chain Reaction for Blood White Cells". J. Clin. Lab. Anal. 13: 133–140.

        2. DNA isolation by a rapid method from human blood samples: effects of MgCl2, EDTA, storage time, and temperature on DNA yield and quality. Lahiri DK1, Schnabel B. Biochem Genet. 1993 Aug;31(7-8):321-8.

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